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圖1 常出現於廢水處理系統之生物除氮途徑

目前含氮廢水處理上仍以硝化反應(圖 1：②＋④)及脫硝反應(圖 1：⑦)為主流，然而在這些「典型」硝化或脫硝廢水處理系統之中，卻經常發生一些「非預期」的反應，以硝化槽為例常常會發生「硝化槽明明是好氧為何總氮消失了?」、「硝化槽為何有時氨可以跟COD一起減少，有時卻不可以?」、「硝化槽總氮消失是否為厭氧氨氧化反應?」、「如果硝化槽總氮可以消失，那是不是就不需要脫硝槽了?」等等。事實上，自然界中氮系物質生物代謝途徑十分複雜(圖  1)，本文目的主要是簡單介紹常見的生物除氮技術，區分哪些現象是由單一菌株進行的生化反應(上篇)，哪些是由多種菌株進行的複合生化反應(下篇)，並且協助釐清一些容易混淆的名稱及功能。

傳統硝化反應：②＋④
傳統的硝化反應(Nitrification)，過去認為是由兩種菌分別進行兩階段的氧化反應：第一階段由好氧氨氧化菌(AOB，Ammonia-Oxidizing Bacteria)以氧為電子接受者，將氨(電子提供者)氧化為亞硝酸，此階段反應常稱好氧氨氧化或是亞硝酸化反應(Nitritation或Nitritification)，AOB屬名是以Nitroso-作為字首：包含Nitrosomonas、Nitrosospira、Nitrosovibrio、Nitrosococcus及Nitrosolobus；第二階段由好氧亞硝酸氧化菌(NOB，Nitrite-Oxidizing Bacteria)以氧為電子接受者，將亞硝酸(電子提供者)進一步氧化為硝酸，此階段反應稱為好氧亞硝酸氧化或是硝酸化反應(Nitratation或Nitratification)，NOB菌屬則是以Nitro-作為字首：包含Nitrospira、Nitrobacter及Nitrococcus。大多數AOB及NOB生理特性上屬無機營性^註2及自營性^註3細菌，因此AOB及NOB一般常見的特性包括：(1)COD通常對其有負面的影響(包括：競爭與抑制)，所以在廢水處理中，如果期望發揮硝化功能，一般都是透過前處理或是在好氧槽最末端當COD降低到一定程度後才會發生硝化反應；(2)菌體生長速率較異營菌慢，這點呼應了COD的影響，因為當COD存在時，生長快速的異營菌與生長緩慢的自營菌共存於同一生物(膜)膠羽時，異營菌便可以展現生長優勢競爭周圍的資源(包括溶氧、微量元素等)，因此操作上在硝化系統之前通常會盡量去除廢水中的COD，同時盡可能的保留下好不容易長出來的硝化菌體；(3)對環境敏感(如溫度及抑制物質)，通常會表現在生長速率的降低，因此當環境條件出現改變，便會使原本生長緩慢的特性凸顯出來。總和以上特性，自營性的硝化菌難免給人一種比較不好照顧的刻板印象。

註2：有機營(Organotrophic)及無機營(Lithotrophic)係指細菌的能量來源為有機物還是無機物。
註3：異營(Heterotrophic)及自營(Autotrophic)係指細菌細胞合成的碳源為有機碳還是CO₂，可參考本網頁文章「什麼是生物處理」，注意有些細菌能量來源可以是同時是有機營(有機物)或無機營(例如：氨)，但是碳源仍是僅能以CO₂的自營性細菌，例如AOB中唯獨Nitrosomonas europara與Nitrosomonas eutropha 屬於兼營菌，將於好氧脫硝進一步說明。

好氧氨氧化反應(AOA)：③
好氧氨氧化古細菌(AOA，Ammonia-Oxidizing Archaea)生理特性與大部分的AOB十分相似。而與AOB差異最大的部分，在於AOA將氨氧化至亞硝酸的中間產物為次硝酸(HNO)，而AOB代謝途徑的中間產物為羥胺(NH₂OH)，其次，AOA對氨的親和性^註4亦較AOB高。AOA菌屬名稱：包含Nitrosopumilus、Cenarchaeum、Nitrosocaldus及Nitrosoaphaera。
註4：對氨親和性愈高，指某菌比較會搶氨的意思，如果用數字來表示，通常會以半飽和速率常數(愈小)表示，以AOA與AOB為例，AOA對NH₃半飽和速率常數約0.003~0.013 μM(海洋性)或0.41~5.2 μM (陸地性)，而AOB則約為30~3,300 μM (Ward. et al., 2011；Kits et al., 2017)，這表示只要水中氨濃度達到0.41~5.2 μM，AOA即可達到最大活性的一半；而氨濃度須達到30~3,300 μM，對AOB才可達到最大活性的一半，換句話說，親和性愈高的菌，在低濃度下愈有利，這裡可以想成一個人10塊錢(對錢的親和性高)就可以過活一個月，跟另一個人需要10萬塊(對錢的親和性低)才能過活一個月的差異。

完全氨氧化反應：⑤
完全氨氧化(COMAMMOX，COMplete AMMonia OXidation)，係指某些NOB可以直接將氨氧化至硝酸的反應，其代謝途徑包含同AOB之氨→NH₂OH→亞硝酸，以及NOB本身之亞硝酸→硝酸 (Daims et al., 2015)。此類NOB生理特性(與AOA相似)對氨的親和性亦遠高於AOB^註5，而目前被發現可進行完全氨氧化的NOB多以Nitrospira為主。
至此，上述好氧氨氧化菌(AOB、NOB與AOA)對氨親合性的排序如下：海洋性AOA>NOB>陸地性AOA>AOB。這個特性使得低氨濃度的環境中(e.g. 海洋、自來水或低濃度的都市污水)，常以AOA或NOB為主導菌群(或是三者比例相當)，反之高氨濃度的環境(e.g.工業廢水或畜牧廢水)則多以AOB為主，然而這些菌(AOA與NOB)的發現也改變原本硝化系統僅以AOB為主的觀點，舉例來說，過去為了進行亞硝酸脫硝(路徑⑦，後續章節說明)或是厭氧氨氧化反應(路徑⑥，後續章節說明)，在硝化反應中控制的手段(包括：NH₃濃度、溶氧、溫度及SRT等)，多為盡可能的保留AOB並且淘汰NOB，來達到亞硝酸累積的目的，但是在一些低氨濃度的廢水中(如都市污水)，卻無法透過如提高NH₃濃度的方法篩選AOB，在一些研究中，例如單槽式厭氧氨氧化系統^註6亦發現系統運轉穩定後竟由NOB(COMAMMOX)取代原本優勢的AOB(林翰璘，2019)，因此COMAMMOX的發現，一方面解釋過去難以解釋的現象，另一方面也促使亞硝酸化控制的方法必須重新檢視。

註5：可行COMAMMOX的NOB，對氨半飽和速率常數約0.063 μM(Kits et al., 2017)。
註6：單槽式厭氧氨氧化係一種好氧氨氧化菌與厭氧氨氧化菌共同存活在同一生物膜的系統，其透過生物膜內外溶氧濃度的梯度變化，使得外層的好氧氨氧化菌進行氨氧化至亞硝酸，隨後再由內層的厭氧氨氧化菌進行總氮的去除，將於生物除氮技術一覽(下)：複合菌株反應進一步說明。

異營硝化反應：②＋④
異營性硝化(Heterotrophic nitrification)類似傳統硝化包括氨氧化及亞硝酸氧化兩階段氧化反應，但是其生化途徑至今仍有許多模糊之處，第一階段氨氧化的部分，依據目前已知的代謝途徑大致分為三種類型：第一種是甲烷氧化菌(MOB，Methane-Oxidizing Bacteria)或稱嗜甲烷菌(Methanotrophs)的共代謝^註7，雖然MOB共代謝類似AOB氧化氨的途徑 (i.e.氨 →NH₂OH→亞硝酸)，但在共代謝過程中無法透過氧化氨獲得能量(進行生長)，此類MOB包括：Methylococus及Methlyomicrobium；第二種是某些異營菌，同時具備氧化有機物與氨的能力，稱為異營性氨氧化菌(HAOB，Heterotrophic Ammonia-Oxidizing Bacteria)，而HAOB主要是在某些環境下例如：溶氧不足或忽高忽低、或是廢水的C/N比>6~10以上時，會進行類似AOB的氨氧化反應，不過HAOB與MOB一樣無法透過氧化氨獲得能量，HAOB包括：Paracoccus pantotrophus GB17、Arthrobacter globiformis與Pseudomonas sp. Strain PB16等(因異營菌分佈極廣，此處不逐一列出)；第三種途徑則有別於前兩者，是透過氧化有機氮^註8產生亞硝酸或是硝酸，然而這種異營性硝化屬於內呼吸反應，主要發生在原本的能量來源或碳源缺乏的環境下，獲得能量的一種方式。
異營性的亞硝酸氧化菌^註9也是同時具備氧化有機物與亞硝酸的能力，雖然其氧化亞硝酸途徑與NOB類似(i.e.亞硝酸→硝酸)，但有別於NOB使用專一性的酵素，而是透過廣泛存在於多種微生物的過氧化氫酵素(Catalase)來進行反應，因此異營性的亞硝酸氧化可被視為破壞亞硝酸毒性的行為，而非原本獲得能量的主要途徑。
異營性硝化菌中少數如Arthrobacter globiformis外，大部分都具備好氧脫硝(Aerobic denitrification，i.e. 路徑⑧或⑨，後續章節說明)的能力，並且異營性硝化通常都會伴隨好氧脫硝一起發生，可能是因為當環境不利進行原本的代謝途徑，於是改進行異營性硝化(無法獲得能量)，並透過接續的好氧脫硝維持生長(可在不利的環境下獲得能量)。然而異營性硝化即便在廢水處理系統中發生，也屬於非典型的反應途徑，一方面是異營性硝化可能都是在環境不利進行原本正常的途徑下發生，另一方面這些所謂「不利的條件」在這些可以進行異營性硝化的菌株間差異過大，導致操作上也不易複製出相同的反應，例如：Alcaligenes faecalis最佳的C/N為10，但是對於Pseudomonas stutzeri而言C/N比一點也不重要(Martikainen, 2022)，因此目前工業應用上仍較少直接採用異營性硝化(+好氧脫硝)作為處理方法。

註7：共代謝是由於某微生物所產生的酵素不具專一性，因此能以主要基質(primary substrate)作為能量來源進行代謝反應的同時，也能對其他化合物(次級基質，secondary substrate)進行降解，此降解次級基質過程稱為共代謝作用。以MOB為例，因為甲烷氧化酵素(MMO)與AOB的氨氧化酵素(AMO)十分相似，當MMO以甲烷為主要基質(電子提供者)進行氧化反應時，「順便」氧化了氨(次級基質)。
註8：進行有機氮的硝化反應的微生物包括：細菌，如Alcaligenes faecalis氧化肟類(oxime)化合物、或是Psedomonas spp.氧化醋羥胺酸鹽(acetohydroxamate)；以及真菌，如Aspergillus flavus氧化天冬胺酸鹽(aspartate)或蛋白腖(peptone)。
註9：可進行異營性亞硝酸氧化的微生物包含：Aspergillus flavus(真菌)、Candida rugosa(真菌)、以及Bacillus badius(細菌)，雖然我很想以HNOB(Heterotrophic nitrite-oxidizing bacteria)來分類(比較好記)，但是目前查不到文獻使用過這個名稱。

傳統異營性脫硝反應：⑦
傳統的異營性脫硝(Heterotrophic denitrification)反應是由異營性脫硝菌，在無氧的環境下以有機物作為電子提供者(大部分情況下由廢水中的COD提供，如果原廢水COD不足則常會額外添加有機物)，將硝酸或亞硝酸作為電子接受者還原至氮氣。此類異營性脫硝菌的分布極廣，包括：Psedomonas、Alcaligenes、Paracoccus、與Bacillus等等。
比較值得一提的是，在有氧的環境下，所有(包括異營性或自營性)脫硝菌都可改以氧氣作為電子接受者進行COD的氧化反應，這也是為什麼脫硝菌即使在好氧的環境下可以存活，但是脫硝系統則被要求必須在無氧的環境下進行。此外，雖然有少部分異營菌可以進行好氧脫硝，但其途徑與一般脫硝途徑完全不同(路徑⑨或⑩，後續章節說明)，並且好氧脫硝大都是在溶氧不足的環境下進行，因此除了操作環境不易維持外，異營菌在此條件下不一定能與其他細菌的途徑競爭，導致同樣操作參數下的反應結果無法複製。

自營性脫硝反應：⑦
自營性脫硝(Autotrophic denitrification)是由自營性的脫硝菌，在無氧環境下大多以非最高氧化態之硫化物(包括SO₃^2-、S₄O₆^2-、S₂O₃^2-、S⁰及S^2-)或是少數以H₂為電子提供者，將以硝酸或亞硝酸為電子接受者還原至氮氣，其中完全以硫化物為電子提供者的自營性脫硝菌主要以Thiobacillus denitrificans為代表，而可以H₂為電子提供者的脫硝菌則以Micrococcus denitrificans^註10為主。
自營性脫硝與異營性脫硝相比(如表1)，除了電子提供者為無機物或是有機物的差異外，自營性脫硝則是產酸的反應，而異營性脫硝是產鹼的反應。根據這些特性，如不考慮原廢水中含有COD的情況，而必須要額外添加電子提供者時，通常以成本為優先選擇，如表1所示，較常使用的甲醇與元素硫添加的重量比例十分相近，因此可依兩者之單價選擇較經濟的處理方法。另外，在一些較特殊的廢水情境下可考慮元素硫脫硝，例如(1)硬度較高的廢水，因為異營性脫硝會產生出碳酸鹼度，易產生積垢，造成機械設備的損壞；或是後段接薄膜單元的系統，可能造成薄膜單元的阻塞；(2)硫酸鹽高的廢水，當硫酸鹽過高的情況下添加甲醇，可能造成脫硫菌與脫硝菌互相競爭甲醇，除了會造成額外的甲醇消耗，還可能導致過多的硫化氫產生。雖然元素硫脫硝具有上述的特殊性，但是元素硫反應時需考量固體表面釋放的速率，可能會限制脫硝的反應速率；何時需要補充元素硫會相較甲醇的添加不直觀；以及元素硫的臭味及保存(工安因素)也是應用時必須考量的部分。

表1 異營性脫硝與自營性脫硝差異

註10：Micrococcus denitrificans除了直接利用H₂(無機營)外，也可以利用有機物(有機營)產生H₂作為能量來源，同時除了可以CO₂(自營)作為碳源外，亦可以乳酸(lactate)、丙酮酸(Pyruvate)、乙醇酸(glycolate)或琥珀酸(succinate)做為細胞合成的碳源，故屬兼營性的脫硝菌。

好氧脫硝：⑧ 或 ⑨
好氧脫硝(Aerobic denitrification)目前大致分為兩種類型的途徑，第一種是由AOB(目前僅發現兼營性的Nitrosomonas europaea與Nitrosomonas eutropha)在低溶氧的情況下進行好氧脫硝，其過程同樣會先進行氨氧化的反應，但是當氧化至NH₂OH或進一步氧化至亞硝酸時，再以特定有機物^註11為能量來源(即電子提供者)，將NH₂OH(路徑⑧)或亞硝酸(路徑⑨)做為電子接受者還原至NO或N₂O，此種反應又稱硝化菌脫硝(Nitrifier denitrification)或Nitrosomonas脫硝(Nitrosomonas denitrification)，這類AOB進行好氧脫硝的目的是在溶氧不足的情況下，透過此種「無氧」呼吸作為取得能量的手段以維持細胞生長，並且極可能是為了快速消耗具有毒性的亞硝酸以避免其累積(因為溶氧低時，NOB可能無法完全將亞硝酸氧化)；第二種是由HAOB進行的好氧脫硝，其代謝途徑與Nitrosomonas脫硝十分相似，都需先進行氨氧化後接續好氧脫硝，其目的也是在低溶氧環境中獲得能量，代表菌株如Paracoccus pantotrophus GB17，當同時以硝酸跟氧氣當作電子接受者，反而可得到比僅以硝酸或是氧氣作為電子接受者時更高的生長速率。
大體而言，好氧脫硝都需要硝化反應作為前置反應，包括AOB的自營性硝化+好氧脫硝，或是HAOB異營性硝化+好氧脫硝，即是俗稱的SND (Simultaneous nitrification-denitrificiation，同時硝化脫硝)，但須注意另有由硝化菌與異營脫硝菌兩種菌共存於同一系統，分別進行的硝化及異營性脫硝反應也稱為SND，此類混菌系統將於生物除氮(下)-複合菌株反應篇中說明。

註11：可利用於好氧脫硝之有機碳物包括：丙酮酸鹽(pyruvate)、乳酸鹽(lactate)、醋酸鹽(acetate)、絲胺酸(serine)、琥珀酸鹽(succinate)、α-酮戊二酸鹽(α-ketoglutarate)或果糖(fructose)等(Schmidt, 2009)。

厭氧氨氧化：⑥
厭氧氨氧化(ANAMMOX，ANaerobic AMMonium OXidation)，主要由厭氧氨氧化菌(ANAOB，ANaerobic Ammonia-Oxidizing Bacteria)以亞硝酸做為電子接受者，將氨(電子提供者)氧化為氮氣及少量的硝酸(僅有細胞合成時才會產生)，目前已發現的ANAOB包含Ca.^註12 Scalindua、Ca. Kuenenia、Ca. Brocadia、Ca. Anammoxoglobus與Ca. Jettenia。
ANAOB在大部分的情況下，其代謝途徑與生理特性都表現得跟無機營菌與自營菌一樣，包括：COD通常對其有負面的影響、生長速率極緩慢、以及對環境變化較敏感等。然而COD中如甲醇確實會對ANAOB造成不可逆的抑制，但是有些有機酸(包括：甲酸、乙酸及丙酸)卻能作為ANAOB的電子提供者，可先將硝酸還原成其生長所需的亞硝酸之後，再進行厭氧氨氧化反應(氨+亞硝酸→氮氣+少量硝酸)，只是這些COD並不會被ANAOB當作合成細胞的碳源，因此ANAOB依然屬於自營菌，而且即便在環境中存在這些特定有機酸，ANAOB依然很難跟其他異營性的脫硝菌競爭硝酸或是亞硝酸，唯獨Ca. Brocadia fulgida對乙酸及Ca. Anammoxoglobus propionicus對丙酸的親和性遠高於所有異營性脫硝菌，也就是說目前只發現這兩種ANAOB存在其對應有機酸的條件下，可以競爭過其他異營性的脫硝菌。
而為何說ANAOB總是給人一種嬌貴的感覺??主因是ANAOB的生長速率實在是很慢，常見細菌的倍增期大約是數分鐘到數小時，或是普遍認為生長較慢的AOB大約是1天，而ANAOB則長達14天以上，再加上亞硝酸如果濃度太高還會造成基質抑制，這才造成過去認為ANAOB很難培養的刻板印象。然而隨著近十年來科學家的努力，更多ANAOB的生理特性逐漸被釐清，只要掌握關鍵的參數，ANAMMOX已不再是難以控制的生化途徑。
最後，在所有脫氮的反應中，為何說ANAMMOX在這眾多的除氮途徑中是一個特殊的存在?舉例來說，與脫硝反應相比(包含異營與自營，甚至包含好氧脫硝)，ANAMMOX完全不需要有機碳源或是硫化物，只需要氨本身(僅需與硝化菌與少量氧氣搭配)就可以完成除氮反應，而且最終產物為氮氣(其他反應例如好氧脫硝最終產物為溫室氣體N₂O，或脫硝反應不完全亦會產生Ｎ₂O)，簡單說是一種最不需要額外資源(氧氣、碳源)的除氮反應。同時，愈來愈多的科學證據也顯示ANAOB與甲烷菌同樣起源於地球剛形成的早期，仍是以甲烷、氨氣、二氧化碳與氮氣為主的寡養環境，而在現今減碳為主流趨勢下，或許只有這些把遠古充滿溫室氣體的地球轉變為目前適合居住環境的單細胞生物可以幫忙解決相關問題。

註12：Ca.(Candidatus)，直接字面的意思為候選的，主要是因為ANAOB目前尚未培養出100%純菌，故所有菌株除二命名(屬名+種名)外，皆會加上一個Candidatus。

參考文獻
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10. 林翰璘，2019，新世代低耗能污水處理技術-厭氧BioNET®/厭氧氨氧化程序處理都市污水，永續水處理技術研討會，工研院產業學院高雄學習中心，高雄市

附錄

表2 常見易混淆氨氧化細菌中/英文名稱及其縮寫

表3 常見易混淆除氮反應中/英文名稱及對應菌株

撰寫人：林翰璘
連絡電話：(03)5732989
E-Mail：itriA50649@itri.org.tw
編輯/校稿：張王冠